Scurtă discuție despre mai multe metode unice de fibre goale în includerea purificarii corpului

Corpii de incluziune (IB) sunt particule de proteine ​​insolubile de înaltă densitate, învelite în membrane formate atunci când genele străine sunt exprimate în celulele procariote, în special în Escherichia coli. Când este observată la microscop, IB este o regiune cu refracție ridicată, care este evident diferită de alte componente din citoplasmă.

Formarea corpului de incluziune este relativ complexă, legată de rata de producție a proteinei în citoplasmă, concentrația de peptide nou generate este mare și nu există suficient timp pentru a se plia, astfel încât să se formeze agregate proteice amorfe. Corpurile de incluziune sunt compuse practic din proteine, dintre care peste 50% sunt produse clonate. Structura primară a acestor produse este complet corectă, dar configurația tridimensională este greșită, deci nu există activitate biologică. Dimensiunea corpului de incluziune este de 0,5-1μm, insolubilă în apă, solubilă numai în denaturanți precum ureea, clorhidratul de guanidină etc.

La E. coli, corpurile de incluziune pot apărea în două locații ale celulei: citoplasmă și citoplasmă periferică. Locația și caracteristicile corpurilor de incluziune în celulă depind de modul în care sunt exprimate proteinele.

Incluziunile din citoplasma E. coli variază în general în diametru de la {{0}},2 la 1,5μm, iar diferitele proteine ​​au diametre diferite, cum ar fi dimensiunea interferonului este de 0,811μm și dimensiunea prorennet este de 1,281μm. În unele cazuri, diametrul unor corpuri de incluziune este mai mare decât diametrul E. coli, ceea ce dând E. coli o proeminență. În general, o celulă are un singur corp de incluziune.

 

Purificarea corpului de incluziune

 

Procesul de purificare a corpului de incluziune este, în general:

Zdrobirea celulelor:

Tehnologia generală de zdrobire a celulelor este: zdrobirea de mare viteză a țesuturilor, omogenizarea omogenizatorului de sticlă, tratamentul cu ultrasunete, metoda de îngheț-dezgheț repetat, tratament chimic (în general folosind tratament cu lizozimă).

 

Include spălarea corpului:

Corpii de incluziune sunt particule solide inactive formate prin aglutinarea intracelulară a proteinelor exprimate de bacterii, care există de obicei sub formă amorfă, insolubilă. În corpul de incluziune, proteina țintă adevărată reprezintă doar aproximativ 50%, iar restul conține lipide, lipopolizaharide, acizi nucleici și heteroproteine, care sunt legate de corpul de incluziune și afectează renaturarea proteinei corpului de incluziune. Prin urmare, spălarea înainte de denaturare este un pas foarte necesar.

În plus, spălarea corpurilor de incluziune este utilă pentru a crește randamentul de repliere a proteinelor recombinante. Prin îndepărtarea impurităților, obstacolele din procesul de renaturare pot fi reduse, astfel încât proteina să poată fi pliată și asamblată corect mai eficient, îmbunătățind astfel activitatea și funcția proteinei‌.

Spălarea folosită în mod obișnuit mai puțin de 1% din detergent neutru, cum ar fi Tween, Triton, Uree și NP40 plus EDTA și agenți reducători 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoetanol repetat de multe ori, deoarece capacitatea de spălare a detergentului este îmbunătățită cu creșterea tăriei ionice a soluției, în spălarea corpurilor de incluziune se poate adăuga NaCl pentru a crește tăria ionică.

Corpii de incluziune pot fi utilizați pentru a îndepărta alte componente ale soluției de descompunere celulară prin centrifugare sau filtrare, ambele profitând de proprietățile fizice diferite ale corpurilor de incluziune.

 

Centrifugarea:

Proteinele corpului de incluziune sunt mult mai dense decât același volum de fragmente celulare, astfel încât corpul de incluziune poate fi separat de restul celulei prin centrifugare. Centrifugarea continuă este operația cel mai frecvent utilizată pentru obținerea corpurilor de incluziune în producția industrială. Deoarece densitatea fragmentelor de celule este mai mică decât cea a corpului de incluziune, viteza de sedimentare este mai mică decât cea a corpului de incluziune. Suspensia și centrifugarea continuă pot centrifuga cea mai mare parte a corpului de incluziune, în timp ce fragmentele de celule sunt îndepărtate treptat.
Filtrare (filtrare cu flux tangențial): Datorită dimensiunilor moleculare diferite ale corpurilor de incluziune și proteinelor solubile, poate fi utilizată metoda de filtrare, ceea ce poate reduce costurile de operare și poate face ușoară extinderea. Filtrarea cu flux tangențial (TFF) este condusă de diferența de presiune transmembranară. Substanțele și impuritățile mai mici decât dimensiunea porilor membranei trec prin membrană, în timp ce impuritățile, cum ar fi celulele cu particule mai mari, sunt prinse. Deschiderea membranei utilizată în general pentru spălarea prin filtrare este de 0,1μm. Microfiltrarea cu flux tangențial cu fibre goale poate face față direct cu conținut ridicat de solid de material lichid, mai puțini pași, operare simplă, membrana poate fi utilizată în mod repetat prin curățare, reducând investițiile în echipamente și costurile de operare, în conformitate cu cerințele producției automate modulare.

 

Următorul este un caz de aplicare pentru spălarea corpului de incluziune folosind coloane de fibre goale Guidling.

Am folosit fibre goale de 94 cm2 0.1-0.45μm pentru a concentra 250 ml lichid (greutatea moleculară a proteinei țintă 17kd). În întregul proces de spălare, au fost investigate rata de recuperare a proteinei țintă și epuizarea fluxului membranar.

0-71min este procesul de concentrare, 71-224min este procesul de spălare și filtrare. Pe parcursul întregului proces de microfiltrare, TMP a crescut treptat, viteza de intrare a lichidului a rămas neschimbată, iar fluxul mediu de material a fost de 12LMH.

Rezultatele au arătat că proteina țintă a fost complet prinsă, iar rata de recuperare a proteinei țintă a fost mai mare de 90%. Coloanele de ghidare din fibre goale sunt stabile și potrivite pentru această aplicație.

 

Dizolvarea corpului de incluziune:

Corpii de incluziune sunt, în general, dizolvați în condiția agentului de denaturare uree sau clorhidrat de guanidină, iar proteinele corpului de incluziune dizolvate sunt complet denaturate, adică cu excepția faptului că structura primară și legăturile covalente sunt reținute, toate legăturile de hidrogen și legăturile hidrofobe sunt distruse și hidrofobe. lanțurile laterale sunt complet expuse.

Ureea și clorhidratul de guanidină sunt denaturanți cu rezistență medie, care se îndepărtează ușor prin dializă și ultrafiltrare. Concentrația generală de uree 8-10M, clorhidrat de guanidină 6-8M. Dizolvarea ureei are avantajele neionizării, neutre, cu costuri reduse, îndepărtarea proteinei după renaturare nu va provoca o cantitate mare de precipitare a proteinelor, iar corpurile de incluziune dizolvate pot fi purificate printr-o varietate de metode cromatografice, așa că a fost utilizat pe scară largă. .

 

Replicarea proteinelor corporale de incluziune:

Proteina recombinată dizolvată trebuie să fie pliată corect pentru a forma o proteină funcțională. Tehnicile de renaturare includ diluarea soluției de proteine ​​până la aproape neutru, îndepărtarea denaturantului, renaturarea pe coloană și cromatografia de filtrare pe gel. Dintre acestea, diluarea soluției de proteine ​​până la aproape neutru și îndepărtarea denaturantului este o metodă clasică comună de renaturare, în special metoda de renaturare prin diluare are cea mai mare rată de utilizare.

Îndepărtarea denaturantului:

Dializa: Avantajul este că volumul nu crește, iar rata de îndepărtare a denaturantului este controlată prin reducerea treptată a concentrației de lichid extern permeabil, dar durează mult timp și se formează ușor agregate de proteine ​​inactive, ceea ce nu este potrivit pentru operare la scară largă și nu poate fi aplicată la scara de producție.

Ultrafiltrare (TFF): ușor de controlat viteza de dializă, fie în cercetare și dezvoltare, test pilot sau producție, poate elimina denaturanții (schimbarea lichidului + concentrație) prin ultrafiltrare (TFF).

 

Purificarea proteinelor corporale cu includere:

Metodele de purificare a proteinelor după renaturare sunt similare cu cele de purificare a proteinelor solubile, și anume cromatografia de schimb ionic, cromatografia de filtrare pe gel, cromatografia de afinitate, precipitarea cu sulfat de amoniu etc.

Corpurile de incluziune nu au activitate biologică, nu este nevoie să vă faceți griji cu privire la pierderea activității proteinelor, iar cantitățile mari de expresie nu vor duce la moartea celulelor și vor maximiza rezistența la atacul proteazei. Fibra goală Jiuling poate fi aplicată în mod flexibil în procesul de purificare din aval a corpurilor de incluziune. În etapa de spălare a corpului de includere, performanță excelentă, în comparație cu spălarea centrifugă, utilizarea fibrei goale de microfiltrare cu tehnologie nouă de vârstă pentru spălarea prin filtrare cu flux tangențial poate scurta foarte mult timpul procesului, iar rata generală de recuperare poate ajunge la mai mult de 90%. Fibra goală Jiuling poate fi, de asemenea, utilizată în etapa de renaturare a proteinelor a corpurilor de incluziune. Turbiditatea lichidului de alimentare filtrat prin microfiltrare cu fibre goale va fi redusă semnificativ, iar rata de recuperare a proteinelor este mare; Utilizarea fibrei goale de ultrafiltrare nu numai că poate elimina denaturanții, ci și poate scurta timpul de încărcare a probei cromatografice, astfel încât să economisească timp, să reducă volumul de umplutură și să reducă costul de producție. Rata de recuperare a fibrei goale de microfiltrare/ultrafiltrare variază în funcție de materiale, iar rata generală de recuperare poate ajunge la 90-95%.

Tehnologia Guidling vă întâmpină să solicitați kituri de testare pentru recenzii aferente.

 

Despre Guidling

Guidling Technology este o întreprindere națională de înaltă tehnologie care se concentrează pe produse biofarmaceutice, culturi celulare, purificare și concentrare de biomedicină, diagnostic și fluide industriale. Am dezvoltat cu succes dispozitive de filtrare centrifugale, casete de ultrafiltrare și microfiltrare, filtru de virus, sistem TFF, filtru de adâncime, fibră goală, etc. Care îndeplinesc pe deplin scenariile de aplicare ale biofarmaceutice, culturi celulare și așa mai departe. Membranele noastre și filtrele cu membrană sunt utilizate pe scară largă în concentrarea, extracția și separarea prefiltrarii, microfiltrarii, ultrafiltrarii și nanofiltrarii. Numeroasele noastre linii de produse, de la filtrare de laborator mică, de unică folosință, până la sisteme de filtrare de producție, testare de sterilitate, fermentație, cultură celulară și multe altele, răspund nevoilor de testare și producție. Guidling Technology așteaptă cu nerăbdare să coopereze cu tine!