Rezumat:

Acest articol examinează doi factori cheie care trebuie luați în considerare în strategiile de purificare a proteinelor: cerințele de aplicare în aval și caracteristicile biologice ale proteinelor în sine. Articolul subliniază că purificarea proteinelor de înaltă calitate este baza pentru fiabilitatea și repetabilitatea datelor experimentale, în special pentru producerea de proteine ​​recombinante. Diferite scenarii de aplicare au cerințe specifice pentru puritatea proteinelor, activitatea sau conținutul de endotoxină, iar caracteristicile proteinelor pot afecta în mod semnificativ strategiile de purificare. Conform cazurilor specifice, articolul ilustrează faptul că proteinele unice ar trebui să adopte scheme de purificare personalizate. În cele din urmă, a fost propus un proces sistematic de producție de proteine ​​(figura 1), subliniind controlul calității procesului complet din selecția sistemelor de expresie, proiectarea construcției până la optimizarea purificării și recomandarea evaluării omogenității și funcționalității proteice prin tehnici biofizice (cum ar fi SEC-MALS, DSF etc.). Acest articol își propune să ofere îndrumări practice cercetătorilor, ajutându -i să formuleze strategii de purificare eficiente și repetabile, bazate pe caracteristicile și cerințele de aplicare ale proteinelor țintă, îmbunătățind astfel calitatea și eficiența cercetării științifice.

 

Figura 1. Diagrama schematică a procesului de producție de proteine

 

Producție de proteine ​​cu cerere ridicată - Exemple de identificare a problemelor, proiectarea strategiei de atenuare și producția corespunzătoare

 

1. Legarea acidului nucleic la proteine:

Când purificați proteinele de legare a acidului nucleic, sunt necesare mai multe etape pentru a elimina contaminarea acidului nucleic. În timpul lizei, trebuie adăugate nucleazele (cum ar fi nucleasa SM (benzonase®) sau DNază sau RNază), dar acizii nucleici legați nu pot fi îndepărtați complet. Înlocuiți etapele de îndepărtare a acidului nucleic, cum ar fi PEI sau precipitația de sulfat de streptomicină, purificarea heparinei sau cromatografia cu schimb de ioni. Prezența acizilor nucleici a fost monitorizată prin raportul de A26 0 nm\/a28 0 nm pe tot parcursul procesului de purificare. Dacă raportul a fost mai mic de 0,6, a indicat că puritatea proteinei a fost relativ ridicată și contaminarea cu acid nucleic a fost minimă. Pentru proteinele cu acizi nucleici puternic legați, ele pot fi denaturate temporar (cum ar fi tratate cu uree) și apoi renaturate. Puncte cheie: Utilizați reactivi de înaltă calitate, tampoane proaspete și coloane curate (curățați cu 0,5 m NaOH înainte de utilizare).

 

2..

Scopul producerii proteinei purificate de feritină cu lanț de feritină grea (MFTH1) este microscopie crio-electronică cu o singură particulă de înaltă rezoluție (crio-em). Vectorul de expresie Escherichia coli codificat MFTH1 nemarcat a fost perturbat cu ultrasunete fără a adăuga nicio nuclează. După încălzire la gradul 7 0, a fost supus precipitațiilor de sulfat de amoniu, dializei și etapelor de excludere de excludere a mărimii. Eșantionul rezultat a arătat prezența unei cantități mari de contaminanți în imaginile cu microscopie crio-electronică (Figura 2A), care a fost complet improprii pentru aplicarea sa. Optimizați pașii. Adăugați nuclează SM în timpul procesului de liză celulară și procesul de dializă după precipitația cu sulfat de amoniu, apoi adăugați etapa de cromatografie de schimb de anion pentru a reduce raportul de A26 0 NM\/A280nm de la 1,4 la 0,8. După cromatografie de excludere a mărimii, raportul dintre A260NM\/A280NM al eșantionului Mfth1 final a fost de 0,56. Imaginile SDS-PAGE și Cryo-Electron Microscopy (Figura 2B) au arătat că proteina a fost foarte pură, ceea ce indică faptul că contaminanții au fost îndepărtați eficient.

Figura 2 lanț greu de feritină mouse

 

 

 

3. Proteină himerică DSRBEC umană (DSRBD-EGF-Chimera):

DSRBEC este format prin fuziunea domeniului de legare a ARN dublu-catenar (DSRBD) al proteinei kinazei umane R și al factorului de creștere epidermică umană (HEGF). Când DSRBD este exprimat în Escherichia coli, acesta prezintă o capacitate de legare a DSRNA extrem de ridicată. După liza celulară, ARN -ul contaminent va împiedica legarea proteinelor recombinante la coloana de cromatografie de afinitate ionică metalică fixă ​​(iMAC). Metodele convenționale, cum ar fi precipitațiile de sulfat de PEI sau streptomicină, tratamentul cu RNază sau soluțiile tampon cu sare ridicat nu pot elimina ARN-ul. Liza celulară a fost efectuată folosind un tampon care conține 4m uree. Supernatantul a fost încărcat pe o coloană iMac, iar 4m până la 0 m uree a fost utilizat încet peste noapte (renaturarea coloanei). Bufferul de renaturare a fost adăugat cu imidazol și eluat din coloana iMac. Rafinarea finală a fost realizată prin filtrarea SuperDex 75 GEL pentru a obține DSRBEC activ funcțional.

 

4. Proteinele legate de cationi divalenți sau alți cofactori:

Pentru proteinele care interacționează cu cationi divalenți, cum ar fi Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+, sau alți cofactori, este crucial să adăugați cationi divalenți specifici (sau alți cofactori) în timpul exprimării. O cantitate mică din aceleași cationi divalenți (sau alți cofactori) este de asemenea necesară în timpul procesului de purificare. Cu toate acestea, trebuie evitată utilizarea oricăror agenți de chelare (cum ar fi EDTA, EGTA) și agenți de reducere a chelației (cum ar fi DTT sau DTE). Atunci când se ocupă de proteine ​​legate de cationi divalenți, trebuie utilizat un amestec de inhibitori de protează fără agenți de chelare pentru a confirma prezența reală a cationilor divalenți (sau a altor cofactori) în proteina purificată prin metode spectroscopice (cum ar fi spectrofotometria de absorbție atomică).

 

5. Ferridoxină recombinantă (RFD) care conține un singur cluster [2FE ± 2s] din cianobacterii termofile Mastigocladus laminosus

Ferridoxina este o proteină solubilă de fier-sulf care participă la reacții de transfer de electroni. Ferroredoxina de tip plantă poartă un singur cluster [2Fe ± 2s] ca acceptor de electroni al fotosistemului I. Escherichia coli BL21 (DE3) a exprimat proteina RFD recombinantă în mediul TB care conține 10mm Fecl3 și antibiotice. Eluarea coloanei de captare iMac a fost efectuată folosind un tampon care conține 10 mm histidină pentru a evita imidazolul și pentru a preveni distrugerea clusterului [2FE ± 2S]. Schimbul de anioni și cromatografia de excludere a mărimii au fost utilizate pentru purificarea și concentrația ulterioară până la 12mg\/ml pentru screeningul de cristalizare. În comparație cu producția recombinantă de ferroredoxină, ferroredoxina naturală purificată din algele albastru-verde Mastigocladus laminosus a obținut o rezoluție mai mare în timpul cristalizării.

 

6. Proteine ​​utilizate ca antigene

Proteinele sunt adesea utilizate ca antigene pentru a recupera liganzii specifici țintă. Primul lucru de luat în considerare este dacă proteina este utilizată pentru imunitatea in vivo pentru a obține IgG convențional monoclonal sau policlonal sau pentru programe care implică IgG de Camel sau procese de selecție in vitro.

 

6.1 antigene utilizate pentru producția de anticorpi de rutină

Când antigenele sunt utilizate pentru a produce anticorpi IgG monoclonali, plierea corectă a antigenului nu este de obicei necesară, deoarece majoritatea anticorpilor monoclonali recunosc epitopii liniari care nu sunt foarte afectați de structura antigenului și chiar antigene denaturate (cum ar fi proteinele corpului de incluziune) rămân eficiente. Cu toate acestea, puritatea trebuie controlată strict pentru a evita contaminanții imunogeni puternici care interferează cu răspunsul imun și provocând dominanța anticorpilor non-țintă.

 

6.2 Screeningul bibliotecii conjugate

Ar trebui acordată o atenție deosebită menținerii conformației naturale a antigenului în timpul procesării bibliotecii Nanobody obținute prin imunizarea cămilei. Spre deosebire de anticorpii convenționali, anticorpii de cămilă (în special nanobodiile) tind să recunoască epitopii structurali, care este legat de structura lor unică a site -ului complementar convex. În mod similar, atunci când se deplasează biblioteci de anticorpi sintetici sau naturali in vitro, antigenul trebuie să mențină o structură care să fie complet în concordanță cu aplicarea țintă. Deoarece procesul de screening în sine nu este părtinitor, dacă antigenul are pliere greșită, agregare sau eterogenitate conformațională, un număr mare de conjugați care vizează epitopii non-naturali pot fi examinate.

 

 

 

7. Proteine ​​care conțin legături disulfură intermoleculare sau intramoleculare sau cisteină liberă

Legăturile disulfură sunt cruciale pentru stabilizarea structurii naturale a proteinelor. În timpul procesului de purificare, la purificarea proteinelor care conțin legături disulfură intermoleculare sau intramoleculare, este necesar să se evite adăugarea de agenți de reducere pentru a preveni modificările conformaționale ale proteinelor, modificând astfel funcțiile lor. Pentru proteinele care conțin cisteină liberă, agenții de reducere sunt indispensabili în toate etapele procesului de purificare, în special în timpul depozitării, pentru a preveni formarea de legături de disulfură artificială. Cei mai utilizați agenți reducători sunt ditiothreitol (DTT), -mercaptoetanol (-me) și Tris (2- carboxietil) clorhidrat de fosfină (TCEP). Pentru rășinile iMac care sunt incompatibile cu DTT sau TCEP, este recomandat să le utilizați și să le înlocuiți cu alți agenți reducători în etapele ulterioare.

 

8. Fragment de anticorp recombinant

Deși structura fragmentelor de anticorp recombinante (cum ar fi nanobodiile) este mai simplă decât cea a IgG, funcția lor depinde de formarea corectă a legăturilor disulfură. În sistemele de expresie bacteriană, chiar și odată cu adoptarea strategiilor de optimizare, pot apărea produse greșite sau pliate parțial, care există atât în ​​partea solubilă, cât și în corpul de incluziune. Mai ascunsă este faptul că chiar și fragmentele de anticorp pliate corect pot forma agregate solubile (agregarea coloidului) prin plăci hidrofobe la suprafață. Astfel de agregate sunt dificil de identificat în testele funcționale de rutină (cum ar fi ELISA), deoarece legarea multivalentă poate masca scăderea afinității monomerilor, dar prezența lor poate afecta serios aplicațiile care se bazează pe dimensiunea moleculei mici (cum ar fi microscopia super-rezoluție). Prin urmare, bazându-se doar pe SDS-PAGE este insuficientă pentru a evalua calitatea eșantionului. Metodele biofizice, cum ar fi filtrarea gelului (Figura 3), trebuie adoptate pentru a distinge monomerii (vârfurile principale) de agregate (vârfurile de volum de excludere). Punctele cheie de control includ: optimizarea mediului redox în timpul exprimării pentru a promova formarea de legături de disulfură și optimizarea condițiilor de stocare după purificare pentru a preveni agregarea. Aceste măsuri sunt cruciale pentru asigurarea monodispersității și funcției fragmentelor de anticorpi.

Figura 3. Filtrarea gelului Separarea agregatelor solubile de nanobodiile

 

9. Fragmente solubile de receptor de limfocite LLT1

Expresia recombinantă a proteinelor dependente de legături disulfură (cum ar fi receptorul limfocitelor LLT1) se confruntă adesea cu dificultăți de pliere. Filtrarea gelului de tip sălbatic LLT1 a arătat vârfuri de agregare și vârfuri dimer (Figura 4A), dar spectrometria de masă a evidențiat greșeală cauzată de cisteină nepereche în dimer (Figura 4B). În acest scop, au fost proiectați doi mutanți: unul a eliminat problema cisteinei, rezultând o scădere bruscă a randamentului (Figura 4A); După introducerea neocisteinei pentru a reconstrui legătura disulfură conformată, mutantul nu numai că a avut un randament ridicat și o stabilitate bună, dar, de asemenea, s -ar putea cristaliza (Figura 4C), iar structura 3D a confirmat că mutantul a format legătura disulfură corectă și a menținut plierea naturală. Acest caz demonstrează că prin proiectarea rațională a legăturilor disulfură conformale, combinate cu filtrarea gelului și analiza spectrometriei de masă, problema de pliere a proteinelor recombinante poate fi rezolvată eficient și se pot obține proteine ​​funcționale cu structuri stabile și randamente ridicate.

Figura 4. Reconstrucția legăturii disulfură îmbunătățește plierea și randamentul LLT1 solubil

 

 

 

10. Proteine ​​ușor agregabile

Purificarea proteinelor recombinante se confruntă adesea cu problema agregării, iar formarea acesteia urmează mecanismul „creșterea nucleării”-o cantitate mică de agregate solubile se formează mai întâi și apoi declanșează o agregare insolubilă la scară largă. Pentru a aborda această provocare, strategiile pe mai multe niveluri trebuie adoptate: în stadiul de expresie, acest lucru poate fi obținut prin optimizarea tulpinii, reducerea temperaturii culturii, folosind medii de cultură modificate sau diferite proteine ​​de fuziune de solubilizare și înlocuirea sistemelor de expresie (celule de insecte\/mamifere), etc. În timpul etapei de purificare, operațiunea rapidă (într-un mediu de 4 grade) (cum ar fi să evite concentrarea excesivă a proteinei și să se afle rapid de purificare ”(cum ar fi să evite concentrarea excesivă a proteinei, iar o„ strategie rapidă de purificare rapidă ”(cum Sec) ar trebui adoptată pentru a elimina prompt nucleele agregate. În general, atunci când sunt soluții tampon de screening, ar trebui luate în considerare factori precum compoziția componentelor, valoarea pH -ului, agentul de disociere sau solubilizatorul (Figura 5). Prin optimizarea fină a detectării ortogonale (cum ar fi SEC, CD, LS, DSF și deplasarea temperaturii pe baza căldurii fluorescente etc.), calitatea proteinelor și cea mai potrivită soluție tampon.

Figura 5. Strategii pentru atenuarea agregării proteice

 

11. Cristalizarea CLK1 kinazei umane (cum să obții loturi reproductibile)

Pentru a obține CLK1 kinază omogenă non-fosforilată pentru studiile de cristalizare, a fost adoptată o schemă de colaborare multi-strategie. În primul rând, a fost co -exprimat cu λ -fosfatază în Escherichia coli pentru a elimina eterogenitatea autofosforilării. Deși randamentul a fost redus, s -a asigurat o defosforilare completă. După capturarea de către iMac, eluantul a fost completat cu stabilizatori (arginină de 50 mm, acid glutamic de 50 mm și 10 mm DTT) pentru a preveni agregarea, concentrată, iar eticheta sa a fost îndepărtată prin digestia TEV. Apoi, oligomerul corect a fost separat de SEC (conținând 5% glicerol și -me). Etapa finală de schimb crucial de anioni distinge între grupuri cristaline (non-fosforilate) și non-cristaline (parțial fosforilate). Este demn de remarcat în special faptul că modul de liză celulară afectează în mod semnificativ stabilitatea proteinelor-metoda de înaltă presiune și temperatură ridicată duce la o agregare ireversibilă a CLK1, subliniind importanța tratamentului ușor pentru prepararea kinazei.

 

 

 

12. Produceți galectină -1 cu capacitate stabilă de legare a ligandului

Pentru a pregăti galectina funcțională -1 pentru studiile de legare a ligandului, strategiile de expresie și de purificare a patru construcții (galectină de tip sălbatic, fără marcare și etichetate, fără marcat și s-au comparat galectina mutantă fără cisteină -1). Descoperirile cheie indică faptul că purificarea cromatografiei de afinitate lactoză poate ecraniza eficient proteinele pliate corect, dar trebuie combinată cu dializă minuțioasă (tampon HEPES) pentru a elimina complet lactoza de pe locul de legare și pentru a restabili activitatea CRD. Galectina de tip sălbatic -1 este predispusă la oxidare și inactivare, iar stabilitatea sa rămâne limitată chiar și în prezența agenților de reducere (Figura 6). Cu toate acestea, mutantul fără cisteină îmbunătățește semnificativ stabilitatea pe termen lung, menținând, menținând în același timp o activitate de aglutinare comparabilă și stabilitate termică (verificată de nanodsf, ITC etc.) prin eliminarea dependenței de obligațiuni disulfură.

Figura 6. Caracterizarea hidrodinamică a galectinei recombinante -1 își dezvăluie instabilitatea

 

13. Îndepărtarea endotoxinei

Metoda de îndepărtare a endotoxinei se bazează pe cromatografie de afinitate, incluzând cromatografie încărcată pozitiv (schimb anion), utilizarea liganzilor policționali (cum ar fi poli-l-lizina (PLL), poliamina imobilizată (polimixină B)) și adăugarea Tritonului surfactant X -114. În timpul procesului de purificare, acordați atenție pregătirii soluției tampon cu apă fără LPS și utilizați noi coloane sau coloane care au fost utilizate doar în alte purificări fără LPS. Pentru contaminarea endotoxinei, sistemul pompei\/fluidului cromatografic poate fi incubat peste noapte în 0. 5M NaOH sau timp de 4 ore în 1. 0 M NaOH. Cantitatea finală de LP -uri din eșantion a fost evaluată folosind reactivul de lizat de limul Limulus Amebocite (LAL) și a fost verificat dacă era sub limita necesară pentru aplicația specifică.

 

14. Complex proteic

Expresia și purificarea complexelor proteice trebuie să fie optimizate în funcție de condiții specifice. Provocările includ instabilitatea sau plângerea greșită a subunităților. Fiecare subunitate poate fi exprimată independent și asamblată in vitro sau co-exprimată pentru a forma complexe proteice funcționale. Proiectarea construcției ar trebui să fie introdusă cu atenție cu etichete de purificare sau de detectare pentru a evita interferarea cu asamblarea, mai ales atunci când informațiile complexe sunt limitate și sunt necesare mai multe optimizări. În timpul procesului de purificare, integritatea și stabilitatea complexului trebuie evaluate. Metodele includ SDS-PAGE (Detectarea subunității), SEC (omogenitate), SEC-MALS (analiza de masă molară), fotometrie în masă sau spectrometrie de masă naturală (verificare în masă). Trebuie menționat că complexul se poate disocia la concentrații mici. În acest moment, metoda cromatografică sau tamponul (cum ar fi prin condițiile de derivă termică sau de screening DSF) trebuie să fie optimizată. Mai mult, reducerea etapelor de purificare poate preveni pierderea subunităților de interacțiune slabă și poate echilibra eficiența de purificare și integritatea complexului.

 

 

 

15. Purificarea complexelor antigen-anticorp

Complexele anticorp-antigen sunt exemple tipice de complexe proteice. Co-cristalizarea lor poate dezvălui modele de legare și poate ghida optimizarea ingineriei anticorpilor. Metodele tradiționale necesită purificarea separată a antigenelor și anticorpilor și apoi amestecarea acestora. Cu toate acestea, studiile recente au arătat că strategiile de co-exprimare și co-purificare sunt mai eficiente. Doar o singură purificare este necesară pentru a obține complexul și, în același timp, antigenele instabile pot fi stabilizate prin anticorpi și chiar se poate obține o expresie fără etichetă. În această situație specifică, filtrarea SDS-PAGE și GEL (SEC) sunt de obicei suficiente pentru a evalua puritatea și calitatea complexului.

 

Rezumat

Purificarea proteinelor este o tehnologie fundamentală în cercetarea științifică. Producția de proteine ​​la scară academică urmează de obicei strategii standard și poate produce proteine ​​solubile la nivel de miligram, care sunt utilizate pe scară largă în biologie structurală, biochimie și cercetare funcțională. Cu toate acestea, cerințele speciale ale aplicațiilor din aval (cum ar fi necesitatea endotoxinei în experimentele animale și fără contaminarea cu nuclează în cercetarea acidului nucleic) sau caracteristicile inerente ale proteinelor (cum ar fi agregarea ușoară, care conțin legături de disulfură sau afinitate ridicată a acidului nucleic) necesită adesea soluții personalizate. Această revizuire, ca răspuns la aceste circumstanțe speciale, propune strategii rafinate, de la selecția sistemelor de expresie, proiectarea construcțiilor (optimizarea etichetelor și a limitelor de domeniu) până la procesul de purificare și introduce controlul calității (cum ar fi SEC, SDS-PAGE, detectarea activității etc.) la etapele cheie. Unele aplicații necesită, de asemenea, o analiză suplimentară (cum ar fi detectarea endotoxinei și determinarea reziduurilor de acid nucleic), similară cu conceptul de „asigurare a calității” (QA) din industria biofarmaceutică, adică pentru a preveni defectele prin procese sistematice. Prin formularea ghidurilor de control al calității și clarificarea standardelor specifice pentru reactivii proteici folosiți în cercetarea științifică, scopul este de a stabili norme mai riguroase de purificare a proteinelor pentru laboratoarele academice, de a spori fiabilitatea și repetabilitatea datelor experimentale și a elimina decalajul dintre cercetarea de bază și standardele industriale.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5