Proces industrial de purificare la scară-aval pentru vaccinul împotriva rinotraheitei infecțioase bovine (IBR) — Secțiunea „Ultrafiltrare”

Rinotraheita infecțioasă bovină (IBR) este cauzată de infecția cu virusul rinotraheitei infecțioase bovine (IBRV), cunoscut și sub numele de herpesvirus bovin tip 1 (BHV-1). Boala se caracterizează în principal prin simptome respiratorii și avort. Pe lângă aceste manifestări clinice, IBR poate duce la scăderea producției de lapte la bovinele de lapte și la scăderea creșterii în greutate la bovinele de carne, având ca rezultat pierderi economice semnificative pentru fermele de animale.

Boala este de natură imunosupresoare. Când apare ca o singură infecție, patogenitatea sa este relativ scăzută; cu toate acestea, atunci când apar infecții mixte cu alte boli virale sau bacteriene, severitatea și daunele cresc semnificativ. Vaccinarea este cea mai eficientă metodă de prevenire și control, având două tipuri principale de vaccinuri disponibile: vaccinuri vii atenuate și vaccinuri inactivate. În prezent, vaccinurile împotriva rinotraheitei infecțioase bovine utilizate în ferme sunt predominant vaccinuri inactivate.

Vaccinurile vii atenuate se caracterizează prin imunogenitate puternică, instalarea rapidă a imunității și o durată lungă de protecție (de obicei mai mult de șase luni). Ele sunt utilizate în mod obișnuit pentru imunizarea de urgență în timpul focarelor de boală. Cu toate acestea, ele prezintă riscuri potențiale de eliminare a virusului, prezintă riscuri pentru vacile gestante și nu pot fi utilizate la bovinele infectate latent, dar asimptomatice.

Vaccinurile inactivate se caracterizează printr-o siguranță înaltă, fără risc de răspândire a virusului sau de revenire la virulență și sunt considerate absolut sigure. Ele pot fi utilizate la bovine în toate etapele, inclusiv la vaci gestante, viței și tauri de reproducție. Cu toate acestea, instalarea imunității este relativ lent și durata protecției este mai scurtă, așa că de obicei sunt necesare imunizări de rapel. În unele cazuri, eficacitatea protectoare poate fi mai slabă decât cea a vaccinurilor vii atenuate.

Indiferent dacă se folosește un vaccin viu atenuat sau un vaccin inactivat, procesul de purificare din aval poate fi împărțit în patru etape principale: recoltare și limpezire → concentrare și purificare primară → purificare prin lustruire → inactivare/filtrare sterilă și formulare.

Concentrarea este o etapă de bază în procesul de purificare din aval a vaccinurilor, imediat după clarificare. Scopul său principal este de a reduce rapid soluția limpezită cu virus de-volum mare, cu concentrație scăzută-la o formă de-volum mic, cu concentrație mare-, menținând în același timp bioactivitatea virală. Acest lucru creează condițiile necesare pentru etapele ulterioare de purificare fină cu rezoluție înaltă-dar-capacitate scăzută, cum ar fi cromatografia.

Această etapă este efectuată de obicei folosind ultrafiltrarea cu flux tangențial (TFF). Principiul este următorul: soluția de hrană virală curge paralel cu suprafața unei membrane de ultrafiltrare cu o dimensiune specifică a porilor. Sub presiune, moleculele mici, cum ar fi apa, sărurile și anumite impurități trec perpendicular prin membrană și sunt îndepărtate, în timp ce particulele de virus intacte, care sunt mult mai mari decât porii membranei, sunt reținute, recirculate continuu și concentrate. În comparație cu centrifugarea tradițională cu viteză mare-, această metodă este mai blândă pentru virușii fragili precum IBRV, care au o înveliș lipidic. Reduce eficient daunele structurale ale virusului și pierderea activității cauzate de forțele de forfecare mari și este mai susceptibilă de a crește-liniar pentru producția industrială.

O operațiune de concentrare reușită este mult mai mult decât simpla reducere a volumului. Punctele cheie pentru optimizarea procesului includ: controlul precis al presiunii transmembranare și al debitului de alimentare pentru a echilibra eficiența filtrării, minimizând în același timp polarizarea concentrației și murdărirea membranei; selectarea materialului adecvat al membranei și a dimensiunii porilor pentru a asigura o retenție ridicată a virusului și flux de permeat; și găsirea echilibrului optim între recuperarea virusului, factorul de concentrare și timpul de procesare. Suspensia virală concentrată nu numai că atinge un titru semnificativ mai mare, dar realizează și purificarea preliminară prin îndepărtarea unei mari porțiuni de impurități solubile în apă-. Acest lucru oferă volumul și baza de concentrație necesare pentru etapele critice ulterioare de rafinare, cum ar fi cromatografia și tratamentul cu nuclează, făcând concentrarea un centru de eficiență central în întregul proces din aval.

Diafiltrarea secundară este o etapă critică în purificarea în aval a vaccinului, poziționată după purificarea fină și înainte de formulare. Se efectuează de obicei după cromatografie și tratament cu nuclează. Scopul său de bază nu este concentrarea inițială, ci schimbul de sistem și ajustarea precisă a condițiilor finale de formulare. Procesul se realizează într-un sistem de ultrafiltrare cu flux tangențial (TFF), în care soluția virală concentrată circulantă se adaugă continuu tampon de formulare proaspăt și curat, în timp ce solventul original și impuritățile de molecule mici-sunt îndepărtate. Această operație elimină eficient și ușor sărurile reziduale, solvenții organici, produsele de degradare a nucleazei și urmele de impurități solubile rămase din procesul de purificare.

Cheia este să mențineți volumul constant sau să aplicați ajustări minore ale concentrației pentru a vă asigura că concentrația virusului îndeplinește specificațiile formulării. Pentru virusurile fragile, încapsulate, cum ar fi virusul rinotraheitei infecțioase bovine (IBRV), mediul hidrodinamic blând al diafiltrației secundare este crucial pentru păstrarea integrității și imunogenității particulelor. În cele din urmă, această etapă oferă o bază solidă pentru inactivarea ulterioară (dacă este necesar), adăugarea de adjuvant sau stabilizator și umplerea finală, asigurând că produsul final intră în formulare cu componente definite, condiții uniforme și compatibilitate bună. Prin urmare, este unul dintre pașii de bază pentru asigurarea siguranței vaccinului, stabilității și consistenței lot-la-loturi.

IBRV este un virus ADN liniar dublu-învelit, cu o înveliș aproximativ sferică. Particulele mature de IBRV au un diametru de aproximativ 160-230 nm. În consecință, utilizarea membranelor de ultrafiltrare de 100, 300 sau 500 kDa poate reține IBRV în timp ce se îndepărtează unele proteine ​​contaminante. Rata de recuperare prin ultrafiltrare a casetelor cu membrană Jiuling Technology variază în funcție de tipul de material de alimentare, dar ajunge în general la 90–95%.