Precauții pentru utilizarea tubului de ultrafiltrare
(1) Selectați tubul de ultrafiltrare corespunzător. În general, greutatea moleculară care trebuie reținută nu trebuie să fie mai mare de 1 / 3 din greutatea moleculară a proteinei țintă. De exemplu, dacă greutatea moleculară a proteinei țintă este de 35kDa, se poate selecta tubul de ultrafiltrare cu greutate moleculară de 10kDa. Dacă greutatea moleculară a proteinei țintă este de aproximativ 10kd, se poate utiliza un tub de ultrafiltrare cu o greutate moleculară de 3KD. Citiți cu atenție manualul de instrucțiuni și acordați atenție toleranței diferite a membranei de ultrafiltrare la diferite substanțe chimice.
(2) Ultrafiltrarea nou cumpărată este uscată. Adăugați apă ultrapură înainte de utilizare, iar apa va trece complet prin membrană. Pre-răciți-l într-o baie de gheață sau frigider timp de câteva minute. Apoi se toarnă apa și se adaugă soluția proteică. Cantitatea adăugată nu trebuie să depășească linia albă de pe partea superioară a tubului. Operația trebuie să fie ușoară. Înainte de a adăuga soluție proteică, tubul de ultrafiltrare trebuie introdus pe gheață pentru precoolare.
(3) Balanță. Atât masa, cât și centrul de greutate ar trebui să fie echilibrate. Rețineți că viteza și accelerația nu trebuie să fie prea rapide, altfel membrana de ultrafiltrare va fi deteriorată direct. Începeți ultrafiltrarea centrifugă (precooling centrifugat la 4 grade). După ce RPM-ul diferitelor centrifuge este transformat în G, este diferit. Reglați accelerația centrifugei la treapta cea mai joasă pentru a reduce presiunea asupra membranei. Rețineți că trebuie să așteptați până când centrifuga atinge viteza țintă înainte de a părăsi centrifuga, altfel atunci când există o problemă cu centrifuga, nu puteți face față primei situații. Direcția membranei și a arborelui rotativ se reglează în conformitate cu instrucțiunile (în cazul centrifugei rotative unghiulare, membrana este perpendiculară pe arbore). În practică, viteza este în general mai mică decât cea din manual, ceea ce poate prelungi durata de viață a țevii centrifuge.
(4) Când este concentrat la restul de 1ml, ia 50ul soluție tampon și se adaugă 10ul pentru a curge prin pentru a vedea dacă devine albastru, astfel încât să se judece dacă tubul de ultrafiltrare scurgeri de proteine. Dacă tubul se scurge, turnați stratul superior și curgeți prin noul tub și începeți ultrafiltrarea. Pentru a judeca cu precizie dacă tubul se scurge, se centrifughează cu 5mgml BSA timp de 10min, apoi se ia fluxul, se execută adeziv proteic sau Bradford pentru măsurare brută și continuă să se adauge soluția proteică rămasă pentru concentrare (funcționează pe gheață pentru a preveni încălzirea proteinei) până când se adaugă toate soluțiile concentrate. Acordați atenție dacă precipitarea proteinelor are loc în timpul centrifugării, ducând la blocarea conductelor. Dacă apar precipitații, determinați cauza specifică a precipitațiilor, dacă concentrația de proteine este prea mare sau tamponul este inadecvat; Prima poate fi rezolvată prin ultrafiltrare simultană cu mai multe tuburi de ultrafiltrare pentru a reduce concentrația. Acesta din urmă este de a schimba diferite soluții tampon până când proteina nu precipită.
(5) Etapele anterioare sunt utilizate pentru a concentra proteinele. Dacă doriți să schimbați tamponul, atunci când soluția totală de proteine este concentrată la aproximativ 1 ml, adăugați ușor un tampon nou (ultrafiltrare prin membrana de ultrafiltrare 0,22um) și apoi concentrați-vă la aproximativ 1 ml timp de trei ori consecutiv. Volumul final al ultimei concentrații depinde de concentrația necesară de proteine, care, în general, nu este mai mare de 500ul, sau poate fi concentrat la mai puțin de 200ul. În funcție de concentrația de volum de cel puțin 10 ori de fiecare dată, poate ajunge la mai mult de 1000 de ori de trei ori, ceea ce poate atinge practic scopul de a schimba tamponul.
