Studiu asupra procesului de clarificare a lizatului de fermentație de înaltă densitate al Escherichia Coli recombinant

 

Pentru a reduce interferența fluidului material la cromatografie și pentru a îmbunătăți recuperarea proteinei țintă, a fost studiat procesul de clarificare a lizatului de fermentație de înaltă densitate a două tulpini de Escherichia coli recombinant. Au fost selectate tulpinile BL21-HP1036 și BL21-palA care exprimă gene cheie ale Streptococcus suis și Haemophilus parasuis. Procesul de curgere tangenţială, procesul de centrifugare de mare viteză şi procesul de clarificare a casetei cu membrană au fost utilizate pentru a evalua randamentul de proteine ​​prin detectarea turbidităţii şi electroforeză.

 

Rezultatele au arătat că BL21-HP1036, BL21-palA lizat de fermentație de înaltă densitate care exprimă genele cheie ale Streptococcus suis și Haemophilus parasuis au fost clarificate prin filtrare și centrifugare pe membrană, iar randamentul proteic a fost de peste 80%, care ar putea reduce în mod eficient interferența cromatografică și ar putea îmbunătăți rata de recuperare.

 

Introducere

În prezent, Streptococcus suis (SS) și Haemophilus parasuis (HPS) sunt cei mai des întâlniți agenți patogeni ai bolilor bacteriene din fermele de porci, care aduc pierderi mari industriei porcine. SS poate fi împărțit într-un total de 35 de serotipuri 1-34 și 1/2, iar HPS poate fi împărțit în serotipuri 1-15, iar cele două sunt adesea amestecate, provocând în principal poliserozită porcină, artrită, meningită, endocardită. , septicemie bacteriană și bronșită.

 

Datorită numărului mare de serotipuri de Streptococcus suis și Haemophilus parasuis, protecția încrucișată între diferitele serotipuri este slabă, iar rezistența la antibiotice va crește semnificativ atunci când este tratată cu antibiotice, ceea ce va afecta efectul terapeutic.

 

Vaccinurile au devenit unul dintre mijloacele eficiente de prevenire a SS și HPS. Există vaccinuri inactivate, vaccinuri atenuate, vaccinuri vii, vaccinuri subunități și vaccinuri modificate genetic, dar vaccinurile inactivate și vaccinurile atenuate sunt în principal pe piață, iar protecția lor imunitară este bună, dar protecția încrucișată nu este evidentă. Vaccinul subunității este un nou tip de vaccin împotriva streptococului suis, care este un nou tip de vaccin cu protecție încrucișată puternică și preț scăzut. Cercetarea și dezvoltarea vaccinurilor subunităților Streptococcus suis și Haemophilus parasuis oferă o soluție perfectă la problemele de prevenire și control ale Streptococcus suis și Haemophilus parasuis care afectează industria porcilor din China.

 

Vaccinurile subunităților Streptococcus suis și Haemophilus parasuis sunt supuse unei fermentații cu densitate mare de către Escherichia coli recombinant. Clarificarea lizatului are un efect mare asupra randamentului proteinelor țintă, dar există puține rapoarte relevante. Cum se realizează etapa de clarificare a procesului de fermentare și purificare este o lucrare importantă. În această lucrare, E. coli recombinant BL21-HP1036, BL21-palA fermentație de înaltă densitate ca obiect, pentru a studia modul de reducere eficientă a turbidității soluției de clarificare, îmbunătățirea randamentului de proteine, pentru Streptococcus suis proces de fermentare a vaccinului subunității pentru a obține tehnologia industrială de zdrobire și clarificare pentru a oferi o bază teoretică și suport tehnic.

 

1. Materiale și metode

1.1 Materiale

 

1.1.1 Tulpini

Tulpinile de Streptococcus suis și Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Principalele medii și reactivi

Extract de drojdie și marsuin; clorură de sodiu; Kanamicină, IPTG; Formaldehidă din; Kit de gel SDS-PAGE.

 

1.1.3 Principalele echipamente de testare

Fermentator de mare densitate; Centrifuga de mare viteza; Aparate de electroforeza; Sistem de imagistică cu gel ultraviolete; Concasor cu ultrasunete; Centrifugă mică de mare viteză; Spectrofotometru cu ultraviolete; Masa de agitare la temperatura constanta; Echipament pentru cromatografie de afinitate.

 

1.2 Metode

 

1.2.1 Cultură de fermentație de mare densitate

Tulpinile de coliformi recombinanți calificați BL21-HP1036 și BL21-pa-lA au fost inoculate pe mediu sintetic la 2% (V/V) și cultivate la 37 de grade timp de 35-40 ore.

 

1.2.2 Expresia indusă de proteine ​​recombinante

Când soluția de fermentație OD{{0}}±0.1, a început inducția, temperatura de inducție a fost de 35 grade ± 0,5 grade și cultura sa încheiat după 10 ore de inducție.

 

1.2.3 Concasare și centrifugare omogenă la presiune înaltă

Lichidul bacterian care a trecut testul de inactivare a fost zdrobit de un omogenizator de înaltă presiune pentru cracarea celulelor, respectiv, cu o presiune de 100~150 MPa. După zdrobire, lichidul zdrobit a fost păstrat la temperatură scăzută.

Supernatantul a fost obținut prin centrifugare cu viteză mare, viteză centrifugă: 15000 rpm, control al temperaturii: 10 grade ~ 15 grade, viteza de injectare: 0,5 ~ 1 L/min, respectiv, supernatantul a fost colectat și supernatantul a fost umplut cu recipiente care au îndepărtat endotoxina.

 

1.2.4 Limpezirea casetei cu membrană de microfiltrare

Membrana a fost spălată cu 10L de apă purificată într-o direcție și a fost efectuată filtrarea cu curgere tangenţială. 300 ml de suspensie bacteriană spartă după centrifugare au fost preluați din centrifuga de conductă și limpeziți cu o casetă cu membrană de microfiltrare de 0,45um. Turbiditatea a fost măsurată prin eșantionare și, respectiv, turbiditatea după centrifugare, turbiditatea lichidului limpezit în caseta cu membrană de microfiltrare și turbiditatea lichidului concentrat în caseta cu membrană de microfiltrare au fost comparate. Conținutul de proteine ​​al probei a fost detectat prin cromatografie și electroforeză pentru a evalua randamentul proteic.

 

Pasul 2: Rezultate

2.1 Date de clarificare și rezultate ale testelor ale proteinei BL21-HP1036 și BL{21-palA

Rezultatele din FIG. 1 arată că turbiditatea fluidului de zdrobire recombinant BL21-HP1036 și BL21-palA a scăzut de la 4 500 NTU și 4 000 NTU la 1970 NTU și, respectiv, 520 NTU, după centrifugarea tubului. Turbiditatea Escherichia coli recombinată BL21-HP1036 și BL{21-palA a fost redusă la 25 NTU și 1,28 NTU prin metoda casetei cu membrană de microfiltrare. Se poate observa că utilizarea filtrării în flux tangențial a casetei cu membrană de microfiltrare și a canalului de curgere deschis optimizat are un efect bun asupra reducerii endotoxinei, vâscozității și turbidității lichidului cromatografic decât filtrarea tradițională prin centrifugă și poate reduce semnificativ heteroproteina E. coli recombinată spartă. și acid nucleic.

 

2.2 Recuperarea proteinelor din probele de BL21-HP1036 și BL21-palA

Tabelul 1 arată că proteina recombinantă Escherichia coli BL21-HP1036 există atât în ​​soluția clarificată prin microfiltrare, cât și în supernatantul concentrat acoperit de membrana de microfiltrare, precum și în randamentul total de proteine ​​după recuperarea proteinei din soluția clarificată prin microfiltrare și din supernatantul concentrat. este de aproximativ 88,5%. Proteina BL21-palA a existat și în soluția limpezită de exudat de microfiltrare și în supernatantul soluției concentrate acoperit de caseta cu membrană de microfiltrare. Randamentul total al proteinei BL21-PALa a fost de 81,5%.

 

3. Concluzie

În această lucrare, tulpinile care exprimă genele cheie BL{{0}}HP1036 și BL21-palA ale Streptococcus suis și respectiv Haemophilus parasuis au suferit o fermentație de înaltă densitate și au trecut de 0,45 Turbiditatea lichidului material a fost redus semnificativ prin procesul casetei cu membrană de microfiltrare um, indicând faptul că tehnologia de filtrare în flux tangențial cu caseta cu membrană de microfiltrare a fost mai bună decât cea cu centrifuga de mare viteză și ar putea reduce semnificativ proteina impurităților și acidul nucleic din Escherichia coli recombinată spartă.

 

După colectarea lichidului limpede în caseta cu membrană de microfiltrare unică, au existat 62,9%, deoarece 37,1% din proteina țintă a BL21-HP1{036 a fost concentrat de microfiltrare sau a existat în caseta cu membrană de microfiltrare și alte pierderi , a fost adoptată o metodă în două etape pentru clarificare. În prima etapă, a fost utilizată o casetă cu membrană de microfiltrare de 0,45 um pentru a clarifica și colecta exudatul; în a doua etapă, lichidul concentrat rămas a fost colectat după centrifugarea tubului, iar lichidul clarificat în două etape a fost combinat ca probă cromatografică. Valoarea turbidității lichidului de fermentație BL21-palA nu a crescut semnificativ, randamentul proteic ar putea atinge peste 85,5%, iar randamentul proteic al lichidului de fermentație BL21-Pala ar putea ajunge la 81,5% după un tratament în două etape.

 

În ceea ce privește alegerea casetei cu membrană de microfiltrare, Guidling Technology vă poate oferi soluții de înaltă calitate. Produsele noastre din seria de casete cu membrană de microfiltrare și casete cu membrană de ultrafiltrare folosesc polieter sulfonă ca purtător, special concepută pentru biotehnologie. Membrana noastră de polieter sulfonă are avantajele unui randament ridicat, adsorbție scăzută de proteine, rezistență mecanică ridicată, rezistență la impact și așa mai departe. Vă punem la dispoziție cleme speciale cu membrană pentru măsurarea presiunii la intrare și la ieșire în timp real și vă putem oferi vizite tehnice în funcție de nevoile dumneavoastră pentru a vă personaliza sistemul special de ultrafiltrare/microfiltrare. Un astfel de sistem de flux tangențial mic poate fi utilizat pentru producție mică, pilot și la scară mică și poate fi o amplificare complet liniară pentru a îndeplini pe deplin cerințele dvs. de testare și cerințele de producție.

Despre Guidling

Guidling Technology este o întreprindere națională de înaltă tehnologie care se concentrează pe produse biofarmaceutice, culturi celulare, purificare și concentrare de biomedicină, diagnostic și fluide industriale. Am dezvoltat cu succes dispozitive de filtrare centrifugale, casete de ultrafiltrare și microfiltrare, filtru de virus, sistem TFF, filtru de adâncime, fibră goală, etc. Care îndeplinesc pe deplin scenariile de aplicare ale biofarmaceutice, culturi celulare și așa mai departe. Membranele noastre și filtrele cu membrană sunt utilizate pe scară largă în concentrarea, extracția și separarea prefiltrarii, microfiltrarii, ultrafiltrarii și nanofiltrarii. Numeroasele noastre linii de produse, de la filtrare de laborator mică, de unică folosință, până la sisteme de filtrare de producție, testare de sterilitate, fermentație, cultură celulară și multe altele, răspund nevoilor de testare și producție. Guidling Technology așteaptă cu nerăbdare să coopereze cu tine!