Tehnologia de inactivare și îndepărtare a virușilor produselor din sânge

Produsele din sânge sunt „componente ale proteinelor plasmatice sau componente ale celulelor sanguine, cum ar fi albumina din sânge uman, imunoglobulina umană, factorul de coagulare uman (natural sau recombinat) concentrat de celule roșii din sânge etc., separat de plasmă umană sănătoasă sau plasmă umană specific imună, purificată sau realizate prin tehnologie ADN recombinant, pentru diagnostic, terapie sau imunoprofilaxie pasivă”. Produsele sanguine joacă un rol important în situațiile de urgență medicală, salvarea leziunilor de război și prevenirea și tratamentul unor boli specifice.

 

Context normativ

Practicile de asigurare a siguranței trebuie să asigure că medicamentul final este sigur pentru autoritățile de reglementare și, în cele din urmă, pentru pacienți și public. În anii 1990, Conferința Internațională de Coordonare (ICH 1998) a emis „Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological products of Human or animal Origin Cell lines” (Q5A: Viral Safety Assessment), stabilind un standard mondial pentru siguranța virală.

ICH Q5A descrie o schemă cu mai multe niveluri de testare și validare pentru a atinge acest obiectiv. Programul de testare se concentrează pe colectarea băncii de celule, a materiilor prime și a bioreactorului, completată de analiza riscului produsului. Pe lângă testare, ICH Q5A necesită ca decontaminarea din aval să fie evaluată ca măsură de siguranță atunci când nu sunt detectați contaminanți în amonte. Verificarea autorizației asigură că, dacă vreun virus se sustrage regimului de testare, acesta poate fi îndepărtat și/sau inactivat înainte de a ajunge în produsul medicamentos final.

 

Context pentru programul general de securitate a virusului

În producția modernă a biotehnologiei (sau bioprocesarea), există de obicei trei sau patru operațiuni unitare în întreaga secvență purificată, capabile să îndepărteze sau să inactiveze virusul. Aceasta include anumite etape cromatografice (cum ar fi proteina A sau schimbul de anioni), cultura de pH scăzut sau detergenți și filtre de reținere a virusului. Nu toți acești pași vor elimina sau dezactiva efectiv toți virușii.

De exemplu, cultura cu pH scăzut este de obicei ineficientă pentru inactivarea virusului neîncapsulat, dar funcționează bine pentru inactivarea virusului încapsulat. În anumite condiții de funcționare, coloana schimbătoare de anioni poate să nu poată lega și îndepărta virușii izoelectrici neutri din fluxul de produs, dar este eficientă împotriva virușilor acizi.

Este o combinație de trei până la patru operațiuni unitare independente și ortogonale care asigură împreună siguranța virusului produselor biotehnologice.

 

În general, se presupune că o etapă de procesare robustă, eficientă și fiabilă va putea elimina sau inactiva un număr mare de viruși (definiți de obicei ca 4 log10 sau mai mare, unde valoarea de reducere a logaritării sau LRV este calculată ca log10 din totalul numărul de viruși din intrare împărțit la numărul total de viruși din ieșire). Cu toate acestea, LRV nu poate fi utilizat ca o singură măsură absolută a eficacității unui pas. Datele pot fi preliminare. Este ușor de modelat, relativ insensibil la schimbările în condițiile procesului și eficient împotriva unei game de viruși (OMS 2004).

Filtrarea virală este recunoscută pe scară largă ca o etapă de proces atât de puternică și eficientă și este o componentă cheie a strategiei generale de minimizare a riscului de particule virale exogene și endogene în timpul fabricării produselor biotehnologice.

Filtrele virale funcționează adesea prin mecanisme puternice de reținere bazate pe dimensiune. Pe baza acestui mecanism puternic de acțiune, filtrele virale sunt mai susceptibile decât etapele cromatografice de a asigura retenția virală previzibilă pentru o serie de viruși. Acest lucru se datorează faptului că filtrul este mai puțin probabil să fie afectat de diferențele dintre proprietățile fizico-chimice ale diferiților virusuri și interacțiunile virus-rășină reglementate de condițiile de funcționare. Prin urmare, etapa de filtrare virală este utilizată în mod obișnuit în procesele de purificare a proteinelor terapeutice recombinate bine concepute (EMEA 1996), care s-au dovedit, de asemenea, a avea performanțe robuste în industria de prelucrare a plasmei.

 

Cu toate acestea, produsele din sânge sunt ca o sabie cu două tăișuri, care nu numai că salvează mii de vieți, dar are și posibilitatea de a răspândi boli și de a reprezenta o amenințare pentru sănătatea umană. Conform statisticilor, din 1977 până în 1984, cel puțin 30,000 primitori de sânge din Statele Unite au primit sânge infectat cu virusul SIDA. În 1985, 1.200 din 3,000 hemofili din Franța au fost infectați cu SIDA prin transfuzii de sânge sau produse din sânge.

Potrivit Organizației Mondiale a Sănătății, 5% până la 10% dintre infecțiile cu SIDA din întreaga lume sunt cauzate de transfuzii de sânge sau produse din sânge infectate cu SIDA. Primul caz de SIDA din China a fost infectat prin utilizarea produselor din sânge importate infectate cu virusul SIDA. În plus, a fost raportată și transmiterea bolilor hepatitei B și C din cauza transfuziei de sânge și produse din sânge.

 

1. Principalele virusuri transmise prin produse sanguine și caracteristicile acestora

Există multe tipuri de viruși care sunt transmise prin sânge și produse din sânge, așa cum se arată în Tabelul 1. Printre acestea, HIV, HBV și HCV au fost preocupate de cercurile medicale interne și străine din cauza ratei lor ridicate de infecție și a vătămării grave.

Deoarece sângele și produsele din sânge au posibilitatea de a răspândi viruși, a afectat serios aplicarea acestuia în prevenirea și tratarea bolilor. Prin urmare, în producția de produse din sânge, trebuie adăugate procese de inactivare și îndepărtare a virusului pentru a asigura siguranța produselor din sânge.

2. Principalele metode de inactivare și îndepărtare a virusului

Pentru a asigura siguranța produselor sanguine, pe lângă selecția donatorilor de sânge, imunizarea acolo unde este posibil și testarea strictă a sângelui recoltat și alte măsuri, inactivarea și îndepărtarea tratamentului cu virus al produselor din sânge reprezintă o verigă importantă pentru a asigura siguranța transfuziei de sânge. Mai jos sunt descrise în detaliu câteva metode eficiente și utilizate în mod obișnuit pentru inactivarea și eliminarea virușilor.

 

I. Metode de inactivare a virusului

1. Metoda Pasteur

Baza teoretică a acestei metode este că rata de distrugere a structurii virusului este mult mai mare decât cea a structurii proteinei prin selectarea temperaturii și a timpului de acțiune. Aproape 50 de ani de rezultate de utilizare clinică și experimente recente pe animale au confirmat că albumina în soluție după un tratament de încălzire la 60 de grade, 10 ore, adică dezinfecția Pasteur, poate nu numai să inactiveze HBV, ci și să inactiveze HCV și HIV, făcând albumina cea mai fiabilă. produs sanguin în siguranță virală.

Recent, procesul lui Pasteur a fost extins la producția de IVIG, FVI, FIX, fibrinogen și alte produse. Bridonnccu et al. a adăugat acest proces de inactivare a virusului la procesul IVIG de producție de etanol la temperatură joasă, adică metoda Pasteur a fost implementată în condițiile fără stabilizator, sare și aciditate scăzute, iar titrul virusului a scăzut cu 5 Log. Simmonds și colab. a testat virusul transmis prin transfuzie (TTV) al preparatelor concentrate FVⅢ și FIX utilizate clinic în Regatul Unit și a constatat că rata de detectare a TTV a produselor fără inactivarea virusului Pasteur a fost de 50% până la 75% și rata de detecție pozitivă de produse după inactivarea Pasteur a fost 0.

Rata TTV pozitivă a fost de 27% la 84 de pacienți cu hemofilie din Regatul Unit care au folosit produse cu factor de coagulare neinactivat, în timp ce doar 1 din 19 pacienți care au utilizat produse cu factor de coagulare inactivat de virus a fost pozitiv, cu o rată de detecție pozitivă de 5%. Prin urmare, procesul de inactivare a virusului este foarte eficient în îmbunătățirea siguranței produselor din sânge.

 

2. Solvent organic combinat cu surfactant (metoda S/D)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Un număr mare de produse sanguine inactivate prin metoda S/D s-au dovedit sigure și fiabile prin aplicarea clinică pe termen lung, astfel încât acestea sunt utilizate pe scară largă. Cu toate acestea, această metodă nu are nicio capacitate de inactivare împotriva parvovirusului B19, HEV și a altor viruși non-acoperiți cu lipo.

 

3. Metoda de inactivare a căldurii uscate

Inactivarea la căldură uscată înseamnă că preparatul liofilizat este tratat prin încălzire și virusul este ucis prin căldură uscată. Metodele de căldură uscată utilizate în mod obișnuit sunt metoda de încălzire de 60 grade ~ 80 de grade , 10 ~ 72 de ore și metoda de tratare la 80 de grade , 72 de ore. Încă de la începutul anilor 1980, a fost util să se încălzească preparatul concentrat liofilizat FVIII și complexul de protrombină la 60 de grade ~ 80 de grade timp de 10 ~ 72 de ore. Cu toate acestea, s-a dovedit că această metodă nu poate inactiva complet HBV, HCV, HIV. Tratamentul termic uscat la 80 de grade și 72 de ore s-a dovedit a fi eficient în inactivarea HBV, HCV și HIV. Au existat, de asemenea, rapoarte recente despre preparate liofilizate de factori de coagulare tratate la 100 de grade. Xu Jinbo și colab. au tratat IgG la 100 de grade timp de 30 de minute și au inactivat virusul stomatitei veziculare 8.2 Log. Unii oameni vor îngheța FVIII liofilizat la 68 de grade timp de 72 de ore, în stare uscată și apoi se vor încălzi la 100 de grade timp de 0,5 ~ 1 oră. Această metodă este relativ economică.

 

4. Metoda fotochimică

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Log de celule legate de HIV și trombocitele au rămas bune după 7 zile de conservare funcțională in vitro, care a fost aprobată de FDA pentru studii clinice.

Printre aceste metode, metoda Pasteur de dezinfecție și metoda S/D sunt aprobate de FDA din Statele Unite și sunt utilizate pe scară largă în lume. Metoda de inactivare prin căldură uscată este potrivită în principal pentru inactivarea virală a preparatelor liofilizate. Metoda fotochimică are un efect puternic de inactivare asupra virusurilor acoperite cu lipide și a fost utilizată în inactivarea virusului total plasmatic în Europa și are perspective largi de inactivare a virusului în componentele celulelor sanguine. Cu toate acestea, toate aceste metode au propriile lor neajunsuri, precum sterilizarea Pasteur nu este ideală pentru inactivarea unor virusuri rezistente la căldură; Metoda S/D nu a putut inactiva efectiv virusul non-acoperit cu lipo. Metoda fotochimică a afectat semnificativ activitatea unor proteine ​​plasmatice. Utilizarea clinică actuală a investigațiilor de urmărire arată că nicio metodă de inactivare a virusului nu poate garanta că produsele din sânge sunt absolut lipsite de riscul de transmitere a virusurilor.

 

I. Procesul de eliminare a virusului

În producția de produse din sânge, un proces de inactivare nu poate inactiva toți virușii; În plus, virusul în sine este o proteină heterologă, cum ar fi intrarea cu produsul va produce reacții adverse; În același timp, din cauza limitării nivelului tehnic, există încă viruși ale căror caracteristici nu sunt găsite sau înțelese, astfel încât metodele de inactivare a virusului existente nu pot garanta efectul de inactivare al acestor viruși. Prin urmare, inactivarea singură nu poate garanta siguranța produsului și trebuie eliminată din produs. Deci, tehnologia de eliminare a virușilor primește din ce în ce mai multă atenție. Două procese de îndepărtare a virușilor utilizate în mod obișnuit și eficiente sunt descrise pe scurt mai jos.

1. Tehnologia cromatografică

Tehnologia cromatografică se referă la utilizarea diferitelor componente și a afinității fazei staționare sau a diferențelor de interacțiune, pentru a realiza separarea diferitelor componente. Ca tehnologie avansată pentru producerea de produse sanguine, cromatografia în sine are ca efect eliminarea virușilor, în special cromatografia de afinitate și cromatografia de schimb ionic. Pentru cromatografia cu schimb de ioni, eluția are avantaje față de penetrare în îndepărtarea virusului. Tabelul 2 prezintă statisticile datelor privind rata de îndepărtare a HAV prin tehnologia cromatografică în procesul de producere a albuminei de către compania CSL din Australia. După cum se poate observa din Tabelul 2, cromatografia cu schimb de ioni și filtrarea pe gel sunt mai eficiente în îndepărtarea HAV, cu o rată totală de îndepărtare de 10,9 Log.

În producerea FVIII, Baxter Healtheare efectuează cromatografia de imunoafinitate folosind geluri tratate cu anticorpi anti-FVIII, care pot elimina (4,2±0.1)Log și (5,3±0.9)Log din non -virusuri acoperite cu lipide, cum ar fi PPV și, respectiv, HAV.

 

2. Filtrare prin nanofilm

Pentru unii viruși cu diametru de suprafață mic, cum ar fi HAV și parvovirusul B19, filtrarea prin nanomembrană este cea mai eficientă metodă de îndepărtare. Profită de diferența de dimensiune dintre proteine ​​și viruși și de adsorbția virușilor de către membrana filtrului pentru a izola virușii. Un studiu de laborator a fost efectuat la Sanquin Blood Supply Site din Țările de Jos privind îndepărtarea virușilor prin adăugarea unei filtrări nanomembrane Planova 15N în două etape la procesul de producție a complexului de protrombină. Sa constatat că ratele de îndepărtare a HIV, HAV și a altor virusuri au crescut în grade diferite după filtrarea nanomembrană (vezi Tabelul 3).

Cu toate acestea, pot apărea următoarele probleme atunci când această metodă este aplicată la producția industrială: În primul rând, datorită vâscozității ridicate a produsului și a prezenței proteinelor cu diametru mare, dimensiunea porilor membranei selectate de filtru nu trebuie să fie prea mică, limitând astfel eliminarea virusurilor cu diametru mic, cum ar fi VHC; În al doilea rând, stabilitatea controlului dimensiunii porilor membranei în procesul de producție a filtrului va afecta îndepărtarea virusului. În al treilea rând, atunci când deschiderea membranei mai mică decât diametrul particulei de virus este blocată, debitul de produs va fi redus, afectând randamentul. Prin urmare, selecția membranelor ale căror proprietăți și dimensiunea porilor sunt potrivite pentru nevoile produselor procesate este un factor important în ceea ce privește dacă filtrarea nanomembrană poate elimina virușii.

 

3. Discuție

Sub premisa asigurării calității sursei de sânge, procesul de inactivare și îndepărtare a virusului este un mijloc important și necesar pentru a asigura siguranța produselor sanguine. Utilizarea unui singur proces viral inactivat nu poate garanta în mod absolut siguranța produselor din sânge. Pe baza tehnologiei de inactivare a virusului, a fost adăugată tehnologia de îndepărtare a virusului, cum ar fi cromatografia și filtrarea nanofilmului, rata de eliminare a virusului a fost mult crescută, iar efectul de inactivare și eliminare a virusului a fost îmbunătățit semnificativ. În prezent, Europa a propus în mod clar ca în procesul de producție a produselor din sânge să fie folosită cel puțin o inactivare și eliminare a virusurilor pentru a asigura siguranța produselor din sânge.

În China, majoritatea producătorilor de produse din sânge utilizează un singur proces de virus inactivat în procesul de producție, cum ar fi metoda de dezinfecție Pasteur, metoda S/D etc., dar nu folosesc procesul de îndepărtare a virusului, care afectează grav calitatea produselor sanguine. Odată cu aderarea Chinei la OMC, procesul de producție și standardele de calitate ale produselor sanguine autohtone vor fi în conformitate cu lumea, în caz contrar, nu poate garanta cota de piață internă existentă, dar nici nu poate concura cu produse similare din alte țări din piata internationala.

Prin urmare, producătorii de produse din sânge din China trebuie să îmbunătățească procesul de producție, să consolideze inactivarea și eliminarea virusului, astfel încât să asigure pe deplin calitatea și siguranța produsului. Prin urmare, va fi tendința ca producătorii chinezi de produse din sânge să folosească cromatografia pentru a purifica produsele din sânge și pentru a elimina virușii pentru a asigura siguranța produselor din sânge.

 

Despre Guidling

 

Guidling Technology este o întreprindere națională de înaltă tehnologie care se concentrează pe produse biofarmaceutice, culturi celulare, purificare și concentrare de biomedicină, diagnostic și fluide industriale. Am dezvoltat cu succes dispozitive de filtrare centrifugale, casete de ultrafiltrare și microfiltrare, filtru de virus, sistem TFF, filtru de adâncime, fibră goală, etc. Care îndeplinesc pe deplin scenariile de aplicare ale biofarmaceutice, culturi celulare și așa mai departe. Membranele noastre și filtrele cu membrană sunt utilizate pe scară largă în concentrarea, extracția și separarea prefiltrarii, microfiltrarii, ultrafiltrarii și nanofiltrarii. Numeroasele noastre linii de produse, de la filtrare de laborator mică, de unică folosință, până la sisteme de filtrare de producție, testare de sterilitate, fermentație, cultură celulară și multe altele, răspund nevoilor de testare și producție. Guidling Technology așteaptă cu nerăbdare să coopereze cu tine!