Studiu privind aplicarea filtrării profunde în procesul de producție al vaccinului împotriva febrei aftoase
Prefață - Ce este febra aftoasă
În secolul al XIV-lea, există înregistrări scrise despre febră aftoasă similară în Europa. Afta aftoasă este o boală acută, febrilă, foarte contagioasă, cauzată de virusul febrei aftoase.
Simptomele clinice ale animalelor adulte includ: creșterea temperaturii corpului, vezicule și ulcerații în gură, vezicule și ulcerații în copite și chiar pierderea cojii copitei, provocând dificultăți în alimentație și somn, scădere în greutate și chiar pierdere a valorii economice la animalele economice. ;
Simptomele clinice ale animalelor tinere includ: temperatura corporală crescută, miocardită și alte simptome, odată cu debut, animalele tinere au o mortalitate ridicată.
Abstract
În ultimii 500 de ani, febra aftoasă a izbucnit în mod repetat în întreaga lume, iar un număr mare de porci, vite, oi și alte animale domestice și ungulate sălbatice au murit sau s-au îmbolnăvit, având un impact grav asupra animalelor. și industria de creștere.
Pentru a studia aplicarea tehnologiei de filtrare profundă în procesul de producție a vaccinului împotriva febrei aftoase, a fost testată și comparată performanța de filtrare a filtrării de suprafață și a filtrării profunde, precum și efectul protector asupra filtrării bactericide. Au fost studiate avantajele filtrării profunde cu sarcină mare în îndepărtarea resturilor celulare. Au fost analizate schemele de filtrare corespunzătoare pentru mediul de cultură celulară cu turbiditate diferită.
Rezultatele au arătat că sarcina de filtrare adâncă a fost de 13,9 ori mai mare decât cea a filtrării de suprafață, turbiditatea lichidului de filtrare a fost de numai 23,5% din filtrarea de suprafață, iar sarcina de debacterizare 0.2um ulterioară a fost de 7,2 ori mai mare decât cea a filtrului. filtrare la suprafață. Prin utilizarea ligandului său special de rășină, turbiditatea lichidului de filtru este de 38,6% din cea a filtrului profund obișnuit cu aceeași dimensiune a porilor, ceea ce este benefic pentru a proteja procesul din aval. Rezultatele au arătat că filtrarea profundă, în special filtrarea profundă cu sarcină pozitivă puternică, ar putea fi aplicată în mod eficient la producția de vaccin FMD și ar trebui stabilite procese de filtrare adecvate pentru diferite medii de cultură.
Afta aftoasă și filtrare profundă
Afta aftoasă (FMD) este o boală acută, febrilă și contagioasă a animalelor cu copite fesificate, cauzată de virusul febrei aftoase (FMDV). Animalele cele mai sensibile la această boală includ bovinele, porcii și oile. Afta aftoasă este endemică în Asia, Africa, Orientul Mijlociu și America de Sud, cu o incidență foarte mare și cu transmitere rapidă. Organizația Mondială pentru Sănătatea Animalelor (OIE) o listează ca fiind prima boală zoonotică de categoria A, solicitând statelor membre să includă febra aftoasă în lista bolilor animale de notificare. Vaccinarea este un mijloc eficient de prevenire specifică a febrei aftoase. Vaccinul inactivat FMD, care se face prin inactivarea virusului intact cu inactivator, joacă un rol important în prevenirea și controlul FMD.
Antigenitatea FMDV în sine este slabă, iar inactivarea virusului are un impact mare asupra antigenului său. Prin urmare, în producția actuală de vaccin FMD, vaccinul FMD de înaltă puritate poate asigura conținutul de antigen și puritatea dozei unitare, ceea ce este deosebit de important și este, de asemenea, strategia actuală de vaccinare. Acest lucru impune cerințe ridicate pentru purificarea în aval a virușilor. În plus, înainte de 2009, în amonte de vaccinuri inactivate împotriva febrei aftoase din China, în cea mai mare parte, a adoptat metoda de cultură de rotire a sticlei și lipire de perete. Odată cu creșterea cererii de vaccinuri, au apărut treptat dezavantajele acestei metode de cultură care necesită un număr mare de sticle rotative, eficiență scăzută și nivel scăzut de expresie.
Prin urmare, în ultimii ani, tehnologia culturii celulare s-a schimbat lent de la cultura aderentă anterioară la cultura în suspensie, iar producția de virus a fost îmbunătățită semnificativ. Cu toate acestea, odată cu creșterea producției de virus, schimbarea modului de cultură a adus o presiune mai mare asupra purificării în aval, deoarece resturile celulare generate de procesul de cultură, eliberarea celulară a proteinelor gazdă, ADN-ul gazdă etc., au crescut în mod corespunzător, ceea ce impune cerințe suplimentare asupra capacității de purificare în aval.
Tehnologia de filtrare cu membrană este utilizată pe scară largă în procesul de producție a produselor biologice, cum ar fi vaccinurile, printre care tehnologia de filtrare DC este de obicei utilizată în procesul de recoltare a veninului bolii pentru a separa impuritățile insolubile, cum ar fi resturile celulare. În clarificarea timpurie a FMDV, a fost adoptată în principal tehnologia de filtrare a suprafeței reprezentată de elementul de filtrare cu membrană pliabilă. Odată cu schimbarea condițiilor de cultură, creșterea impurităților reziduurilor celulare, filtrarea de suprafață este dificil de a obține efectul de clarificare și, deoarece sarcina de filtrare a suprafeței este scăzută, costul materialelor de filtrare devine din ce în ce mai mare.
În contextul de mai sus, filtrarea profundă a fost aplicată din ce în ce mai mult în procesul de separare a citolichide a FMDV. Materialul filtrant profund este de obicei compus din fibre lungi și fine din surse naturale, iar canalul format de mediul filtrant după formarea unei pelicule este adesea foarte sinuos, asemănător cu structura deschiderii labirintului. Particulele de impurități sunt adesea prinse în interiorul filtrului, mai degrabă decât pe suprafață. Mai mult, peretele canalului de filtrare absoarbe adesea o parte a impurităților extrem de fine prin acțiune electrostatică sau forță intermoleculară. În general, mecanismul de filtrare al filtrării profunde se caracterizează prin retenție mecanică și adsorbție.
Metoda de filtrare cu curent constant
Instalați placa de filtrare adâncă pe dispozitivul de filtrare cu curent constant, spălați placa de filtrare cu tampon PBS peste 54 L/m2; După ce spălarea este terminată, porniți pompa peristaltică pentru a pompa încet lichidul, reglați încet viteza pompei la aproximativ debitul așteptat și filtrați lichidul. Înregistrați volumul de filtrare, timpul, diferența de presiune și turbiditatea în timpul procesului de filtrare. Filtratul a fost colectat pentru detectarea antigenului.
Avantajele filtrării profunde
Filtrarea de suprafață este o tehnologie care captează particulele de pe suprafața materialului filtrant pentru a realiza filtrarea. Mecanismul de filtrare se bazează în principal pe dimensiunea particulelor din sita de fluid, particulele mari sunt prinse pe suprafața membranei filtrului. Filtrarea profundă utilizează canale interne pentru interceptarea particulelor și adsorbția la adâncime. Diagrama de comparație a celor două este prezentată în Figura 1.
Soluția inactivată de vaccin împotriva febrei aftoase de la un anumit producător a fost prefiltrată cu membrană de suprafață din polipropilenă 0.45um și, respectiv, placa filtrantă adâncă, și apoi filtrată cu filtru bactericid 0.2um. Datele de filtrabilitate sunt prezentate în Tabelul 1.
Turbiditatea soluției inactivate de vaccin împotriva febrei aftoase este de 77 NTU. Dacă bacteria este filtrată direct, un număr mare de fragmente celulare va determina inevitabil blocarea rapidă a membranei filtrului 0.2um, ceea ce va afecta transmiterea viparticulelor 146S. Prin urmare, prefiltrarea a fost proiectată înainte de filtrarea de debacterizare și au fost comparate cele două metode de prefiltrare de filtrare profundă și filtrare de suprafață. Placa de filtrare adâncă cu două straturi este selectată pentru filtrare, sarcina este de 641 L/m2, iar filtrul adânc reduce materialul de 77 NTU la 9,65 NTU, care este clar și luminos. Sarcina de filtrare la suprafață de 0.45um este de numai 46 L/m2, iar turbiditatea lichidului de filtrare este de până la 41 NTU, ceea ce nu este potrivit pentru prefiltrare. Conform comparației ulterioare 0.2um sarcină de filtrare debacterizată, încărcarea membranei de filtrare debacterizată după filtrarea profundă este de 655 L/m2, ceea ce este de 7,2 ori mai mare decât sarcina de filtrare de suprafață corespunzătoare (doar 91 L/m2) .
Rezultatele testului 146S arată că randamentul sistemului de filtrare profundă este mai mare decât cel al sistemului de filtrare de suprafață. Sarcina de filtrare profundă a fost de 13,9 ori mai mare decât cea a filtrării de suprafață, turbiditatea lichidului de filtrare a fost de numai 23,5% față de filtrarea de suprafață, iar sarcina ulterioară de filtrare 0.2um care înlătură bacteriile a fost de 7,2 ori mai mare decât cea a filtrării. filtrare la suprafață. Prin urmare, atât din punct de vedere al costului, cât și din punct de vedere al randamentului, sistemul de filtrare profundă este semnificativ mai bun decât sistemul de filtrare cu membrană de suprafață.
Avantajele filtrului puternic cu sarcină pozitivă profundă
Placa de filtrare profundă cu sarcină pozitivă și placa de filtrare profundă cu încărcare pozitivă puternică au fost utilizate pentru a compara soluția inactivată de vaccin împotriva febrei aftoase din diferite surse. Rezultatele de filtrare sunt prezentate în Tabelul 2, iar modificarea vitezei de filtrare și a diferenței de presiune în procesul de filtrare este prezentată în aspectul de culoare 2.
Cele două grupuri de plăci de filtrare adânci utilizate au aceeași precizie a deschiderii, iar performanța este foarte consistentă din punct de vedere al modificării sarcinii și a diferenței de presiune, iar curba de modificare a diferenței de presiune din Figura 2 este practic identică.
Cu toate acestea, din turbiditatea lichidului de filtrare, diferența este foarte mare. Lichidul de filtrare al plăcii de filtrare cu strat dublu încărcat pozitiv este de 25 NTU, în timp ce lichidul de filtrare al plăcii de filtrare cu strat profund încărcat puternic pozitiv, cu aceeași deschidere, este de numai 9,65 NTU, ceea ce reprezintă doar 38,6% din placa de filtrare adâncă obișnuită. Acest lucru se datorează în principal ligandului special de rășină din materialul de filtru cu plăci de filtrare profunde cu sarcină pozitivă puternică. Turbiditatea este redusă la mai puțin de 10 NTU de placa de filtru cu două straturi puternic pozitive, iar fragmentele de celule sunt complet adsorbite sau prinse, ceea ce este favorabil procesului ulterioar de ultrafiltrare sau filtrare bactericidă. Pe lângă efectul de adsorbție asupra resturilor celulare insolubile, Yigzaw Y și colab. au raportat, de asemenea, efectul de îndepărtare a plăcii de filtrare profundă puternic încărcată pozitiv asupra proteinei celulei gazdă, iar Dorsey N și colab. au raportat efectul de îndepărtare a plăcii de filtrare profundă puternic încărcată pozitiv. pe ADN.
Stabilirea procesului de filtrare de clarificare pentru supernatantul vaccinului împotriva febrei aftoase prin filtrare profundă
Prin studiul comparativ de mai sus al filtrării de suprafață și al filtrării profunde și prin studiul efectului de clarificare al plăcii de filtrare profundă cu sarcină pozitivă specială, diferite scheme de filtrare ar trebui să fie corelate cu supernatantul inactivat al vaccinului împotriva febrei aftoase produs în diferite condiții. condiţiile de cultură. Pentru supernatantul centrifugal cu 3 turbiditate diferite, turbiditate scăzută, turbiditate medie și turbiditate ridicată, schema de filtrare profundă și parametrii de filtrare corespunzători sunt prezentate în Tabelul 3.
Pentru supernatantul centrifugal cu turbiditate scăzută, placa de filtrare adâncă cu un singur strat poate clarifica și îndepărta eficient o cantitate mică de resturi celulare. Pentru supernatantul centrifugal de turbiditate medie, placa de filtrare adâncă cu strat dublu poate clarifica eficient, în special placa de filtrare profundă cu sarcină pozitivă puternică poate reduce turbiditatea la mai puțin de 5 NTU; Pentru supernatantul centrifugal cu turbiditate mai mare, placa de filtrare combinată poate fi clarificată eficient. Indiferent de proces, capacitatea de procesare este de 500 ~ 800 L/m2, turbiditatea lichidului de filtru este mai mică de 20 NTU, iar antigenul țintă este complet recuperat, potrivit pentru producția la scară largă.
Discuţie
În anii 1970, mediile filtrante au fost specificate să nu folosească materiale din azbest, din cauza prezenței substanțelor cancerigene în materialele din azbest. Materialul filtrant profund nu conține azbest și are o sarcină pozitivă mai puternică. Materialul filtrant este fabricat din matrice de fibre de lemn și auxiliar de filtrare. În procesul de producție, rășina polimerică este utilizată pentru a conecta componentele de bază, iar grupurile funcționale de sarcină pozitivă din aceasta oferă eficient capacitatea de adsorbție a sarcinii materialului de filtrare profundă. Performanța excelentă a filtrării profunde cu adsorbție asupra capacității de captare a particulelor fine este prezentată în Figura 3.
În acest experiment, au fost selectate diferite componente de rășină și diferite materiale de filtrare profundă de precizie pentru a clarifica testul de filtrare a soluției de cultură FMDV, iar testul de comparație a fost efectuat cu filtrare de suprafață. Rezultatele au arătat că filtrarea profundă a fost mai potrivită pentru îndepărtarea resturilor celulare decât filtrarea de suprafață, ceea ce a condus la unitatea de filtrare ulterioară de control al încărcării microbiene (0.2um). În plus, comparând efectul de filtrare al plăcii de filtrare profundă cu sarcină pozitivă puternică și al plăcii de filtrare adâncă cu încărcare pozitivă obișnuită, placa filtrului cu încărcare pozitivă puternică arată o capacitate puternică de control al turbidității, care poate reduce turbiditatea la mai puțin de 5 NTU, ceea ce este foarte propice pentru îmbunătățirea robusteței întregului proces de filtrare.
Procesul de cultură din amonte are o mare influență asupra etapelor de recoltare a ingredientelor active. Prin testare, acest experiment a stabilit în cele din urmă o schemă de filtrare scalabilă pentru mediile de cultură celulară cu turbiditate diferită, care are o anumită semnificație de ghidare pentru producția la scară largă.
Filtrul de adâncime care urmează să fie lansat de Guidling Technology este un element de filtru de tip disc, care este un fel de element de filtrare eficient cu carton de filtrare adânc ca material de filtrare, care îndeplinește pe deplin cerințele de reglementare ale biofarmaceutic, în principal proiectat și fabricat special pentru îndepărtarea conținuturi solide mari, cum ar fi celule și fragmente de celule, și pot fi aplicate fluidului de cultură de celule de mamifere; Clarificarea lizatului de bacterii și celule de drojdie; Îndepărtarea proteinei celulei gazdă (HCP); Eliminați virusul și DN-ul; Eliminarea endotoxinelor; Îndepărtarea antispumantului.
Produsul are avantajele unui volum mort mic, amplificare liniară, structura capsulei discului, designul structurii compacte și poate fi utilizat în serie cu alte echipamente, amprentă mică, debit stabil, durată lungă de viață și cost redus.
