Share de literatură|Spune la revedere de la purificarea complexă? O nouă metodă TFF + Surfactant îmbunătățește eficiența și reduce costurile în producția vectorială AAV

Terapia genică se dezvoltă rapid, cu toate acestea, costul ridicat rămâne o barieră majoră care împiedică accesul mai larg al pacientului. Printre factorii cheie ai acestui cost se numără procesul de producție complex al vectorilor de virus asociat (AAV) Adeno -. Un studiu publicat în biotehnologie și bioinginerie a dezvoltat o nouă metodă de purificare care combină filtrarea fluxului tangențial (TFF) cu surfactanți, care promite să simplifice procesul de purificare AAV și să reducă costurile. Să intrăm în această cercetare condusă de o echipă de la Universitatea din Tokyo.

 

1. Fundal de cercetare: provocări și starea actuală a purificării AAV

Vectorii AAV au devenit instrumente de livrare „stele” în terapia genică datorită siguranței lor ridicate, imunogenității scăzute, capacității de a infecta atât celulele de divizare, cât și non - și capacitatea de exprimare a termenului lung -. Cu toate acestea, procesul lor de producție este complex, în special etapele de purificare în aval, care implică de obicei mai multe runde de centrifugare și cromatografie. Aceste metode sunt timp - consumatoare, forță de muncă - intensă, dificil de scalat și costisitoare.

La scara de laborator, purificarea se bazează adesea pe ultracentrifugarea gradientului de densitate de iodixanol, ceea ce este dificil la scară pentru producția industrială. Cromatografia de afinitate este din ce în ce mai utilizată, dar condițiile scăzute de eluție a pH -ului de care necesită pot afecta infecțiozitatea virală. Prin urmare, dezvoltarea unei metode de purificare AAV simple, eficiente, blânde și scalabile este esențială.

Filtrarea fluxului tangențial (TFF) este o tehnică de separare bazată pe dimensiune - utilizată în mod obișnuit pentru concentrare și tampon - schimbând bioproducturi. Cu toate acestea, TFF convențional are o capacitate limitată de a elimina impurități precum proteinele cu celule gazdă (HCPs) și ADN în timpul purificării AAV, lăsând adesea agregatele proteice în urmă.

 

2. Abordare inovatoare: TFF combinat cu agentul tensioactivi pentru o purificare eficientă

To overcome the limitations of traditional TFF, researchers Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa, and colleagues at the University of Tokyo devised a clever strategy: using surfactants to inhibit aggregation and interaction of impurity proteins, allowing them to pass through the TFF ultrafiltration membrane (500 kDa molecular weight cutoff) while retaining AAV viral particles (~25 nm in dimensiune).

Au testat trei tipuri de surfactanți:

• Non - ionic:Glucozidă octil
• Anionic:Deoxicolat de sodiu
• Zwitterionic:CHAPS

Studiul a constatat că utilizarea unui agent tensioactiv non - singur a fost ineficient. Atât anionicul deoxicolat de sodiu, cât și Zwitterionic CAP -uri au îmbunătățit semnificativ îndepărtarea proteinelor reziduale și au vizat diferite populații de proteine. În cele din urmă, combinarea deoxicolatului de sodiu 0,5% cu 1% CHAP -uri a produs rezultate remarcabile, eliminând aproape complet proteinele gazdă reziduale. Analiza paginii SDS - a arătat doar cele trei benzi de proteine ​​Capsid clare AAV (VP1/VP2/VP3).

 

Figura 1. Procesul de purificare a TFF fără agentul de tensioactivi;(a) SDS - Electroforeza gelului paginii; (b) Microscopie electronică de transmisie (TEM)

 

Figura 1. Procesul de purificare TFF cu agentul tensioactivi;(a) SDS - Electroforeza cu gel de pagină; (b) Microscopie electronică de transmisie (TEM)

 

3. Rezultatele cercetării: puritate ridicată, activitate și siguranță

1. Înlăturarea eficientă a impurității:Noua metodă a obținut 99,98% îndepărtarea HCP și 95% îndepărtarea ADN -ului, cu puritatea comparabilă cu sau depășind cea a cromatografiei de afinitate.
2. Infectivitate îmbunătățită:Experimentele in vitro au arătat că vectorii AAV1 au purificat folosind această metodă celule HEK293 infectate mai eficient decât cele purificate prin cromatografie de afinitate (24,9% față de 20,8%), ceea ce indică o mai bună conservare a bioactivității virale.
3. Siguranță bună in vivo:În urma injecției locale de vectori AAV1 purificați în mușchiul scheletului de șoarece, nu s -a observat o inflamație semnificativă sau o deteriorare a țesuturilor după două săptămâni, demonstrând o bună siguranță in vivo.
4. Aplicabilitate largă de serotip:Metoda a purificat cu succes multiple serotipuri -, inclusiv AAV1, AAV5, AAV8 și AAV9-din supernatante de cultură celulară. Cu toate acestea, pentru AAV2, care există în principal în lizatele celulare cu sarcină de mare impuritate, este necesară o optimizare suplimentară.

 

4. Rezumat și perspective

Acest studiu a dezvoltat un proces de purificare AAV simplu, rapid (1,5 ore), eficient și scalabil. Combinând deoxicolatul de sodiu și CHAPS, a abordat cu succes provocarea agregării proteice reziduale în timpul purificării TFF.

Avantajele metodei includ:

• Evitarea condițiilor dure de pH scăzute, păstrarea mai bună a activității virale
• Reducerea pașilor de cromatografie, simplificarea fluxului de lucru și economisirea timpului și a costurilor
• Ușor scalabil, potrivit pentru producția de scară mare -
• Oferirea unei noi strategii pentru purificarea altor biomacromolecule, cum ar fi exosomi, alți viruși și anticorpi recombinați

Limitările curente includ recuperarea virală suboptimală și incapacitatea de a separa capsidele goale de particulele virale complete, ceea ce sugerează că cea mai bună utilizare a acesteia poate fi ca prim - pas în trepte într -un flux de lucru multi -.

În concluzie, această cercetare oferă o nouă opțiune atractivă pentru producția de vector AAV din aval și are potențialul de a reduce semnificativ costul medicamentelor cu terapie genică, facilitând aplicarea lor mai largă.